Como projetar um Sequencing Primer

Os melhores primers de sequenciamento são sequências únicas que recozimento apenas para o trecho pretendido de DNA modelo com precisão a temperatura de gama média . Eles não formam lacetes em grampo --- isto é, dobra para trás e que se emparelham --- nem se fundir com o outro iniciador ( forma dímeros de iniciadores ) . Instruções
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Projete o primer com base em um comprimento de seqüência de pelo menos cinqüenta nucleotídeos de distância das extremidades do DNA template que você deseja estender. Você quer uma boa sobreposição .
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Escolha uma seqüência que não tem longos trechos de qualquer uma das bases , especialmente longos trechos de Gs ou Cs.
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Escolha um comprimento entre 18 a 30 nucleótidos de comprimento com pelo menos 40 a 60 por cento de conteúdo de GC . Isto lhe dará um ponto de fusão ideal ( Tm) faixa de entre 45 a 65 graus Celsius.
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Confira a sequência contra seqüências no GenBank para ter certeza de que você não escolheu um sítio ativo , tais como um domínio comum que primo não especificamente a múltiplos genes.
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Certifique-se que 3 ' (três prime) final do seu cartilha não é tão pesado em Gs e Cs que se liga a vários sites
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. Escrever ambos os primers na 5 'para 3' (cinco privilegiada para três prime) direção ao fazer o pedido . Isso vai exigir que você escreva o complemento reverso do seu primer reverso .