Protocolos para uma Cultura de Tecidos

A cultura de tecidos geralmente se refere ao crescimento e manutenção das células de animais fora de seu hospedeiro original. É uma parte fundamental da biologia molecular e fornece insights sobre uma variedade de mecanismos da doença . As culturas de células são mantidas em meios de cultura de células contendo os micro- nutrientes macro e necessários para o crescimento , sais inorgânicos para regular o pH e antibióticos para limitar a contaminação . A cultura de tecidos é realizado em cabines de fluxo laminar especialmente concebidos , e superfícies de trabalho são higienizados para reduzir o risco de contaminação. Reconstituição

Durante a reconstituição , o frasco de células é retirado a partir do armazenamento e colocado num banho de água regulado ou incubadora a 37 ° F durante um a dois minutos . Cuidado é tomado para não incubar o frasco por muito tempo para evitar danos às células. As células são então centrifugadas para remover o meio de armazenamento , re - suspensas em meio de cultura de pré -aquecida e transferida para um vaso de crescimento , em que é incubado a temperatura óptima , geralmente 37 graus F.

Basics of sub -cultura

sub -cultura é feito para aumentar a quantidade de células , mantendo-os na fase log de ​​crescimento . As células crescem exponencialmente , dependendo da quantidade de espaço disponível . Uma vez que o espaço é maximizada , as células chegar a uma fase conhecida como confluência completo, onde as células não mais se proliferam e começam a morrer . Sub -cultura varia ligeiramente de acordo com o tipo celular e taxa de crescimento .
Sub -cultura Processo

As células aderentes são ligados ao fundo do recipiente de crescimento , e são removidos após a decantação meio gasto , ou mecanicamente por meio de raspagem , ou com enzimas , tais como tripsina , que separa as células a partir da superfície . Em contraste , linhas celulares contínuas circulam dentro do meio de cultura e são separadas durante a centrifugação . As células são centrifugadas para remover tripsina e mídia. As células são então reunidas num pelete e re - suspensas em meios de cultura . Uma pequena parte da re- suspensão é manchado com corante Trypan Blue , contadas e avaliadas quanto à viabilidade , ou manualmente usando um microscópio e hemocitômetro , ou por um contador de células automatizado. De acordo com os requisitos de taxa de crescimento e de laboratório , uma concentração celular específica é colocado num vaso de cultura contendo um volume apropriado de meio de cultura fresco .

Armazenamento

células de cultura de tecidos armazenado em azoto líquido ou num congelador abaixo de -130 graus Celsius . O equipamento de protecção é necessária quando colocar ou remover as células de nitrogênio líquido. Uma concentração conhecida de células viáveis ​​é suspensa em meios de armazenamento , tais como dimetil -sulfóxido ( DMSO ) e o glicerol , transferido para um frasco de armazenamento apropriada e colocada em azoto líquido ou um congelador . A taxa de resfriamento é controlada por unidades de congelamento eletrônicos ou recipientes com álcool para garantir declínio da temperatura não é muito drástico para causar qualquer dano celular .