Como fazer uma linha celular estável
células estáveis linhas são células modificadas em laboratório para expressar sempre uma certa células gene.These ajudar os cientistas a realizar uma análise da função dos genes , a descoberta alvo e validação , desenvolvimento e ensaio de triagem composto . Dependendo do tipo de expressão de genes e a construção de genes ( também chamado um plasmídeo ) , há muitas abordagens diferentes para o estabelecimento lines.Things celulares estáveis que você precisa
Células
Transfecção reagente
plasmídeo de DNA com neomicina gene
G418 antibiótico
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clonar o gene em um plasmídeo que codifica um gene de resistência a antibióticos ( neomicina : neo) . Se o ADN de plasmídeo não tem este gene , pode co – transfecção de uma outra plasmídeo com o gene neo . ( A transfecção é a introdução de ADN numa célula receptora e subsequente integração do ADN no ADN cromossómico da célula receptora . ) Importância de um gene de resistência a antibióticos é que após a transfecção , as células que não têm o ADN do plasmídeo vai morrer , e apenas as células que tem ele vai crescer em meios de crescimento mergulhada – antibiótico .
2
crescer as células que precisam ser feitas estável para registrar fase . Esta fase é quando o número de células em um meio de cultura aumenta exponencialmente.
Você precisará de aproximadamente 1 milhão de células por transfecção. Estas devem ser as células aderentes , que são aqueles que atribuem à cultura de tecidos prato.
3
Chapa 1 milhão de células na 10 centímetros cultura de tecidos de 24 horas antes de transfecção.
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no dia seguinte, após o plaqueamento , transfectar 10 microgramas de ADN para as células utilizando o reagente de transfecção .
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Setenta e duas horas após a transfecção , utilizar tripsina , uma enzima , para remover o as células a partir da placa de cultura de tecido ( também chamado ” trypsinizing ” ) . Replate as células em pratos de cultura de tecidos de seis . O meio de crescimento deve ter G418 antibiótico para seleção neomicina.
6
Vai demorar cerca de duas semanas para as células a crescer. Continue mudando os meios de crescimento com G418 ou outro tipo de antibiótico .
7 Uma vez
, as células atingiram o número máximo que pode crescer na placa de cultura de tecidos, trypsinize e replate -los em diluições. Usando um anticorpo adequado , você pode colher alguns deles para confirmar a presença do gene de interesse.
