Como identificar uma glicoproteína Através de um reagente Bradford

glicoproteínas são proteínas com carboidratos que lhes são inerentes . Tal como acontece com todas as proteínas , você pode usar o reagente Bradford para determinar se glicoproteínas estão em uma solução e calcular sua concentração . O reagente de Bradford é um corante que se forma um complexo entre as proteínas em solução e o reagente Azul Brilhante G , fazendo com que todos os três para se ligarem em conjunto . O complexo , quando lida com um espectrómetro , irá absorver luz a um máximo de 595 nm , em vez de 465 nm , que é o comprimento de onda no qual o reagente de Bradford por si só iria absorver . A quantidade de absorção é proporcional à quantidade de proteína ( ou glicoproteína , como o caso pode ser ) nas solution.Things você precisa

espectrofotómetro de luz

Ensaio placa

Micropipetas

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Aqueça o espectrofotômetro . Ligá-lo e deixá-lo ligado por pelo menos 15 minutos antes da utilização .

2

Prepare “padrões” na placa de ensaio . Padrões são soluções contendo quantidades conhecidas de glicoproteína para o qual você estará testando seu composto experimental. Obtenção de leituras de absorbância para estes padrões conhecidos e, posteriormente, uma curva de calibração que parcelas conhecido concentração versus absorbância , lhe permitirá quantificar a quantidade de proteína em suas amostras desconhecidas.

Para preparar seus padrões, preencher todos os 12 poços em uma linha de uma placa de ensaio com 100 microlitros de água destilada , utilizando-se uma micropipeta . Para o primeiro poço , adicione 100 microgramas de glicoproteína por pipetagem . Use uma micropipeta para homogeneizar completamente a glicoproteína e água destilada em conjunto : pipeta cima e para baixo . Este primeiro poço mais concentrado contém uma proporção de 50 microgramas de glicoproteína com 50 microgramas de água . Remover 100 microlitros de líquido misturado a partir desse primeiro poço e pipeta no segundo poço . Misture bem por pipetagem cima e para baixo . A concentração deste segundo poço é de 25 microgramas de glicoproteína de 50 microgramas de água . Remover 100 microlitros do poço segundo, pipeta no terceiro poço e repita o procedimento para todos os poços subsequentes na fila até chegar a última também. O último poço deve ser composto apenas de água destilada e possui 0 microgramas de glicoproteína , por isso não pipeta no passado também.

Em outras palavras, cada um dos poços de padrão deve ter 100 microlitros de fluido neles e deve diminuir , em conteúdo de glicoproteína , pela metade a cada vez, a partir de 50 microgramas a 0 microgramas.

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Coloque 100 microlitros de seu composto desconhecido em um poço vazio de sua placa de ensaio . Você não precisa para diluir o bem desconhecida, porque você não precisa de uma curva de calibração a partir do desconhecido. Portanto , cada um desconhecido que você está testando para glicoproteínas requer apenas um poço em placa de ensaio. O desconhecido deve conter uma estimativa de entre 5 e 100 microgramas de glicoproteína. Essa estimativa aumenta a probabilidade de que as leituras de absorbância de seu desconhecido cairá sobre a curva de calibração que você obter de seus padrões.

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Adicione corante e reagente , em quantidades especificadas pelo fabricante do kit de reagentes, a as normas e incógnitas. Aguarde cinco minutos para permitir a formação do complexo .

5

Leia a absorção de ambos os padrões e as incógnitas no espectrofotômetro . A partir dos padrões , obter uma curva de calibração de valores de absorbância versus concentração conhecida . O espectrofotômetro deve formular automaticamente isso para você, mas se não, fazer a sua própria curva. Usando um programa de gráficos — ou graficamente os valores de absorção de papel — trama no eixo x e de concentração conhecida no eixo y . Ajuste uma linha de melhor ajuste para a curva de calibração para obter a sua relação entre absorbância e concentração.

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Ligue os seus valores de absorbância matérias para as amostras desconhecidas em sua fórmula curva de calibração , para obter a concentração de glicoproteína em sua amostra.