Como extrair Invitrogen Trizol RNA
TRIzol extração de ácido ribonucléico (RNA) é um método comprovado e eficaz para qualquer número de tecidos celulares e tipos. Podem ser adicionados passos opcionais adicionais para otimizar a extração de determinados tecidos de plantas recalcitrantes , mas a maioria das células vai desistir de seu RNA para este método. RNA extraído por este método é geralmente de alta qualidade para mais reactions.Things enzimáticas que você precisa
clorofórmio
Isopropanol
pipetas
Homogeneizador
Centrífuga
Escala
Mais instruções mostram
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Homogeneizar 50 a 100 miligramas (mg) de tecido em 1 mililitro ( ml ) de reagente TRIzol com um copo de Teflon ou homogeneizador de energia para libertar o RNA . O método irá variar com as células cultivadas em monocamada ou em suspensão; nestes casos, a lise celular pode ser realizada por meio de pipetagem de vários tempos em vez
2
Isolar excesso de proteínas , gordura , polissacáridos e os tecidos da planta , com o seguinte passo de centrifugação opcional : . rotação seus tubos de centrífuga com uma definição de não mais do que 12.000 rcf ( força centrífuga relativa) durante 10 minutos a uma temperatura de 2 a 8 graus centígrados (C ) . Remova qualquer camada de gordura superior e descarte. O sobrenadante resultante manterá a ARN; remover este para um tubo fresco e descarta a pelete .
3
incubar a amostra homogeneizada durante cinco a 10 minutos à temperatura ambiente ( 15 a 30 graus Celsius ) . Em seguida, adicionar 0,2 ml de clorofórmio por cada 1 ml de Trizol . Tapar o tubo firmemente e agitar manualmente durante 15 segundos. Incubar novamente — durante dois a três minutos à temperatura ambiente e , em seguida, — , centrifugar a não mais do que 12.000 rcf durante 15 minutos, a 2-8 ° C. A mistura deve ser agora em três fases : uma inferior vermelho , fenol fase de clorofórmio; uma interfase; e uma fase superior incolor chamada a fase aquosa . Remover a fase aquosa para um tubo fresco — esta fase contém o ARN .
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Adicionar 0,5 ml de álcool isopropílico por 1 ml de Trizol para a fase aquosa e , em seguida, incubar durante 10 minutos a 15 a 30 graus C. Siga a incubação com centrifugação a não mais do que 12.000 rcf durante 10 minutos a 2-8 ° C. deverá ser capaz de ver um pelete de RNA do tipo gel , na parte inferior do tubo .
5
Descartar o sobrenadante com cuidado pipetagem fora . Secar o pellet de RNA por cinco a 10 minutos, mas não seque-o completamente ou você não será capaz de ressuspender -lo. Dissolver o sedimento em água isenta de RNase ou 100 por cento de formamida desionizada por mistura com uma pipeta e depois da incubação durante 10 minutos a 55 a 60 graus C.
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Armazenar a -70 graus C.
