Como construir vectores de expressão

Um genoma humano consiste de 3 x 10 ^ 9 pares de bases dentro de 24 cromossomos, ainda não toda esta informação genética é usada. As regiões ativas do genoma são chamados de ” genes “, que detêm as informações usadas para produzir proteínas. Um gene é transcrito por ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) , que em última análise é traduzido por ribossomos em proteína.

vetores de expressão são utilizadas em biotecnologia para produzir muitas cópias de uma proteína específica . Por exemplo , a insulina para tratamento da diabetes é produzido em massa com o auxílio de vectores de expressão . Instruções

Construindo um vector de expressão

1

determinar a sequência de DNA da proteína específica . Uma vez que a sequência de DNA da proteína é determinada , cortar a sequência de DNA do genoma utilizando uma enzima de restrição específica . As enzimas de restrição reconhecem e cortar a uma sequência específica do genoma .

2

inserir o DNA específico no vector . Um vector é uma molécula de ADN que introduz o ADN estranho numa célula hospedeira , utilizando as enzimas da célula para produzir a proteína a partir do ADN estranho .

3

inserir uma sequência de promotor a jusante do gene de interesse . Um promotor é uma região que é reconhecida pela ARN-polimerase , que se liga à sequência e começa a transcrição do gene . Adicionar a enzima ligase para ligar a sequência do promotor para o gene de interesse .

4

Inserir o vector de expressão numa célula hospedeira por meio de transformação , induzindo furos transitórios ( utilizando sal ) na membrana da célula . O vector de expressão pode então ser transcrita por ARNm e traduzida em proteína .

Triagem para um vector de expressão

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executar um teste de rastreio para determinar se a célula hospedeira tem a vector de expressão . A célula hospedeira é primeiro banhado utilizando a técnica asséptica ( passando o equipamento através de uma chama ) para uma placa de ágar para o crescimento da cultura celular .

6

Transferir algumas células a partir da placa de agar em um disco de papel de nitrocelulose . Quebrar as células do disco , tratando-as com sal. Isto vai libertar o conteúdo da célula para o disco.

7

submergir o disco de papel de nitrocelulose com uma solução de uma sonda de um anticorpo específico , com um marcador fluorescente . O anticorpo irá ligar-se a proteína produzida pelo ADN de interesse .

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Expor o disco de papel de nitrocelulose, à luz UV . Se a célula tem o vector de expressão , a célula irá fluorescência sob a luz UV , devido à ligação do produto de proteína com o anticorpo com um marcador fluorescente

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Extrair o produto de proteínas através de métodos de purificação .; que pode então ser usada para fins medicinais.