Como Purificar por HPLC

cromatografia líquida de alta pressão ( HPLC ) é um processo de cromatografia utilizadas na separação e purificação de amostras . É uma técnica de separação sólido – líquido, em que a separação de uma mistura com base na afinidade da substância polar do tampão líquido , ou a adesão da substância não polar na coluna , também conhecido como ” semelhante dissolve semelhante . ” HPLC é um método rápido e sensível para a separação , à medida que cada corrida geralmente leva de 30-60 minutos , dependendo do tamanho e do tipo de coluna utilizada , enquanto absorvâncias das amostras são detectados por um computador . HPLC tem tipicamente uma bomba de solvente de alta pressão para bombear o tampão através do sistema , um injector para injectar a amostra para o sistema , uma coluna , um detector e um gravador de dados que é a execução do programa no computador ligado ao sistema de HPLC . Coisas que você precisa

sistema de HPLC e software amostra

Protein

tampão A

tampão B

Seringa

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Preparação

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Aliquote 20 ul da amostra para um tubo de filtro de centrifugação e dissolvê-lo em 60 uL do solvente , o tampão A , a qual é utilizada no início do funcionamento ( como dissolve semelhante ) . O filtro de centrifugação remove quaisquer partículas grandes ( detritos, precipitam , etc ), que podem não se dissolvem no solvente , tal como a coluna permite apenas pequena ( menos de 2 ^ m ) de partículas e filtra as partículas grandes . Isto pode criar uma obstrução no filtro da coluna quando existem muitas partículas grandes para filtrar , a criação de uma pressão mais elevada no sistema . As partículas mais pequenas no sistema aumenta a resolução da amostra coluna e exibe um pico mais distinta .

Girar o tubo a 10.000 rpm a 4 graus Celsius durante um minuto numa microcentrifugadora . A preparação da amostra é importante para maximizar o rendimento de eluição e eficiência do sistema.

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Comece o sistema de ligar o computador eo sistema de HPLC. O computador está ligado directamente ao sistema de HPLC, para receber dados a partir do detector . Depois de o computador recebe o sinal a partir do sistema , o programa de HPLC vai ser aberto .

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Lavar o sistema com o tampão A, a 5ml/min durante 20 minutos . Isso é para evitar cristalização tampão em torno das válvulas e para lavar quaisquer partículas que permaneceram no sistema. Durante este processo , verifique e aperte para vazamentos e gotejamentos para evitar perda de pressão ou a formação de bolhas . Verifique os níveis de líquidos de tampão A e B.

Amostra Run

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O local de injecção tem um interruptor que pode ser virado manualmente entre “Load ” e ” Inject . ” Para a posição de “Load” , injetar a amostra no local da injecção com uma seringa. As bolhas podem ser formadas no corpo da seringa , o que vai causar picos errantes para ocorrer no cromatograma . Toque no barril e expulsar as bolhas. Outros métodos incluem a lavar a seringa com um solvente mais forte antes de carregar ou recarregar a amostra na seringa por deprimente e reprimir o êmbolo com cuidado para evitar mais formação de bolhas na amostra.

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Escreva o exemplo informações para o programa antes de provar correr para garantir os resultados estão associados com a amostra correta.

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Acione o interruptor para ” injetar ” para a execução do programa ea amostra serão veiculados através do sistema . Injection deve ser feito rapidamente para evitar o acúmulo de pressão no sistema . A amostra será executado através de um sistema de 5 circuito antes de ir para a coluna . Isso é para garantir que a amostra é dissolvida em tampão A antes de entrar na coluna.

Cada execução amostra demora cerca de 28 minutos , de acordo com o tipo de solvente e gradiente de pressão que está programado para a corrida .

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Recolha da amostra uma vez que é visto de um ponto no programa . Esta será a amostra que é purificado a partir de compostos que estão presas na coluna.

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Durante a segunda metade da amostra de execução, o programa vai apresentar um segundo tampão ( tampão B ) na sistema para eluir as proteínas abundantes elevados ligados à coluna . Perto do final da corrida , tampão A é reintroduzido no sistema. Este regenera a coluna para a próxima corrida da amostra.