Como IP, em seguida Sonda Fosfoproteína

Muitas proteínas e enzimas no corpo tem a sua função modificada através da adição ou remoção de um grupo fosfato a partir de um resíduo de aminoácido na proteína . Os níveis destes fosfoproteínas são transitórios , e pode ser difícil de medir em um ambiente de laboratório de pesquisa. Fosfoproteína pode ser medido através da remoção da proteína a partir de um ambiente celular que utiliza a imunoprecipitação , seguindo-se a medição dos níveis fosfoproteína usando um anticorpo criado contra a fosfoproteína , em oposição à proteína não fosforilada . Instruções

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Lyse suas células por aquecimento em um tampão de lise . Embora existam vários tipos de buffers de lise , todos eles contêm detergentes para romper as membranas celulares , produtos químicos para inibir a alteração dos níveis de fosfoproteína , e sal e buffers replicando o ambiente interno da célula para estabilizar conformações de proteínas.

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Incubar o lisado numa solução contendo um anticorpo criado para a proteína alvo . Para obter os resultados mais fiáveis ​​, incubar um soro contendo um excesso de anticorpo . Isto pode ser determinado por experiências de titulação de correr para medir a afinidade de ligação do anticorpo .

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Incubar soro em uma solução contendo um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo utilizado para atingir o seu proteína . Isto irá agregar os anticorpos e a sua proteína alvo em grandes aglomerados que podem ser facilmente removidos a partir da solução .

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precipitado da proteína alvo por centrifugação do soro incubadas numa centrífuga . Retire o líquido e secar o pellet restante para remover o excesso de soro.

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Detectar a forma fosforilada de sua proteína alvo. Tentando atingir apenas o phosphoprotein usando imunoprecipitação é imprecisa . Um método comum é a dissolver o sedimento immunoprecipittion e executar um western blot , um método em que a proteína é separado num gel de SDS -PAGE , em peso molecular , transferido para uma membrana de nitrocelulose e expostas a anticorpos para medir os níveis de proteínas específicas .