Como expressar genes em procariotas Eukaryotics
células procariotas são encontrados predominantemente em bactérias e archaea . Eles consistem de várias moléculas biológicas , incluindo DNA, as proteínas e enzimas rodeados por uma membrana celular simples . Estas moléculas de executar todas as funções biológicas da célula . Uma célula eucariótica é encontrado em plantas mais complexas e animais . Ele contém organelos celulares ou de órgãos , cada um responsável por uma função biológica específica . Todos os organelos estão rodeados por uma membrana celular complexa e parede celular . Os genes , as quais normalmente incluem segmentos de ADN , têm sido frequentemente transferido entre as células procariotas e eucariotas , como parte da evolução da natureza . O mesmo pode ser demonstrado em laboratório, utilizando técnicas de transferência de gene , como transformação e transfection.Things você precisa
cultura Escherichia coli
caldo Lauria
laço Inoculação
Incubadora
1 ml de detergente ou esclarecer shampoo banho
Hot Water Fotografia de álcool Fria
papaína extrai
293 células T
Dulbecco Modified Eagle Medium ou DMEM
cloreto de cálcio
HEPES -buffered solução salina
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1
Adicionar um laço cheio de cultura de E. coli para estéril caldo Lauria em um tubo de ensaio usando um loop de inoculação estéril. Incubar o tubo de ensaio a 37 graus Celsius por 24 a 36 horas.
2
Mix 5 mililitros de solução de E. coli a 1 mililitro de detergente em um tubo de ensaio e coloque em um banho de água quente a 55 a 60 graus Celsius durante 10 minutos . Isto vai libertar o ADN a partir das células bacterianas . Adicionar extratos enzima papaína para o tubo de ensaio e colocá-lo no banho de água quente por mais 20 minutos . Isto irá eliminar as proteínas indesejáveis ligadas a ADN .
3
Adicionar álcool frio a solução para criar uma camada de cerca de 1 cm na parte superior da solução bacteriana . Deixe a solução descansar por dois ou três minutos . O DNA vai precipitar na solução de álcool.
4
crescer uma monocamada de 293 células T em meio DMEM a 37 graus Celsius. Isto deve ser feito 24 horas antes do processo de transfecção .
5
Misturar 10 microgramas de ADN com 61 microlitros de cloreto de cálcio e 0,5 ml de água destilada . Adicionar a solução de 0,5 ml de solução salina tamponada com HEPES , misturando suavemente enquanto a adição .
6
Adicionar esta mistura sobre as linhas de células T 293 e incuba-se a 30 graus Celsius, durante 16 a 24 horas . O cálcio carregado positivamente e o fosfato carregado negativamente combinar com o ADN e de entrar nas células eucarióticas . Este método geralmente leva a única expressão de curto prazo dos genes transferidos.
