Protocolos BL21 Transformação

BL21 é uma cepa da bactéria Escherichia coli comumente usados ​​em pesquisas em biologia molecular. Esta estirpe pode produzir quantidades elevadas das sintases de óxido nítrico neuronal da enzima , que catalisa a produção de óxido nítrico a partir do aminoácido arginina . De acordo com a revista Proceedings, da Academia Nacional de Ciências (PNAS) , é intrigante que um organismo procariótico simples, como E. coli tem a capacidade de expressar uma enzima de mamíferos complexos como nNOS . BL21 é produzido por meio de engenharia genética , e os seus protocolos transformações ocorrem frequentemente através de choque térmico ou electroporação , uma técnica que altera o campo electromagnético na solução das células . Transformação Celular Protocolo

Técnicos colocar as células em gelo durante 10 minutos. Em seguida , acrescentam quatro microlitros de DNA na solução de células e misture bem com uma ponteira . Eles colocam a solução de volta no gelo por 30 minutos, choque térmico as células usando um 107,6 graus Fahrenheit banho de água por 45 segundos , e depois colocar de volta no gelo por mais dois minutos. Finalmente , os técnicos de espalhar a solução de células em placas de meio LB Kan , e incuba-se a 98,6 graus centígrados , durante 6 horas . Expressão da proteína é induzida utilizando isopropil- beta -D- 1- thiogalactopyranoside .

BL21 Transformação por eletroporação Protocolos

Técnicos preparar um meio de cultura celular sem soro e avaliar a viabilidade prévia para realizar a electroporação , através da coloração com azul de tripano , seguido por observação microscópica . As amostras são colocadas num aparelho denominado um electroporador . De acordo com Martin J. Tymms em ” factor de transcrição de protocolos , ” como tensão aumenta , a viabilidade celular diminui . As condições de electroporação que reduzem a viabilidade até 50 por cento são também as condições em que a expressão do gene está próximo máxima . ” Expressão gênica ” refere-se à produção de proteínas específicas , de acordo com relativa segmentos de DNA .

Inserção do CITS e transformação de células BL21

Este protocolo envolve a transformação de E. coli BL21 , cultivadas em meio caldo Luria em 98,6 graus Fahrenheit. Transportador citrato ( CITS ) foram expressos em E. coli BL21 adicionando o químico carbenicilina na concentração de 100 mg por ml . Actividade de transporte de citrato nas linhagens recombinantes foi detectado como halos azuis ao redor colônias em placas de ágar citrato de Simmons . A actividade da fosfatase alcalina foi detectada como colónias azuis em placas de agar Luria broth contendo o substrato cromogénico de fosfato de 5 – bromo – 4 – cloro – 3 – indolilo ( sal de toluidina; XP ) . Numa concentração de 40 mg por ml