Como Mudar subclasses IgG

Imunoglobulina G , ou IgG , é um anticorpo feita por linfócitos – B . Os anticorpos são importantes para a imunidade e ajudar a defender contra micróbios patogênicos e toxinas. Os anticorpos monoclonais de ratinho IgG são geralmente produzidos em laboratório, em linhas de células de hibridoma e utilizados para várias aplicações médicas . Ratos têm quatro subclasses de IgG : IgG3 , IgG1 , IgG2a e IgG2b , nomeados na ordem em que ocorrem no DNA. Um anticorpo IgG3 podem alternar aleatoriamente para IgG1 , que podem alternar aleatoriamente para IgG2b e assim por diante . Esse chaveamento aleatório pode ser usado para isolar e produzir todas as quatro subclasses de IgG por ensaio ELISA local , como descrita pela primeira vez em um estudo publicado na ” Journal of Métodos imunológicos . ” Coisas que você precisa célula equipamentos e reagentes cultura

estéril

IgG3 secretoras linha celular

placas de ELISA e reagentes

anticorpos IgG anti-rato , sem rótulo e marcada com HRP

Incubadora

capa

Show Mais instruções

1

crescer o seu anticorpo IgG3 dos pais na linha de células de hibridoma . Comece com a subclasse IgG3 para obter todas as quatro subclasses. Comutação subclasse acontece na ordem dos genes de IgG ocorrem no ADN . Uma vez que a linha celular muda de uma subclasse para outro , o primeiro gene da subclasse ( parental ) é perdido a partir do DNA . Subclasse de comutação não pode acontecer na ordem oposta .

2

Placa da linha celular IgG3 em uma placa de cultura de células estéreis de 96 poços , 1.000 células por poço em 200 mcl . Cultivá-la durante uma semana. Colheita 100 mcl de mídia e testá-lo com um ensaio ELISA

3

Brasão . Os 96 bem – placas ELISA com uma cabra anti- rato anticorpo IgG1 sem rótulo em tampão fosfato salino — PBS . Adicionar mídia e incubar 1 1/2 horas. Lavar as placas com PBS e adicionar o anticorpo secundário — cabra marcado com HRP anti – rato de anticorpo IgG1 . Incubar durante 1 1 /2 horas . Lavar depois com PBS . Adicionar substrato de HRP e incubar durante 30 minutos . Adicionar solução de parada e ler com um leitor de placas de ELISA a 450 nm.

4

Combinar algumas IgG1 – positivo também para a placa de cultura de célula original. Colheita das células a partir desses poços e placa 100 células por poço de uma nova placa de 96 poços de cultura de células . Cinco a 10 placas no total Plate. Crescer durante uma semana e repetir o ensaio ELISA .

5

células placa do poço positivo para uma nova placa de 96 poços de cultura de células de uma célula por poço . Placa de cinco a 10 placas no total e crescer durante duas semanas. Tela de cada bem em uma base diária para o crescimento celular e marque os poços que mostram uma colônia de uma única célula . Isto irá assegurar que a linha de células produtora de IgG1 veio a partir de uma única célula e é idêntico . Repita o teste ELISA.

6

Repita o de uma célula -per- bem chapeamento de poços positivos. Repetir o ensaio ELISA .

7

células colheita IgG1 – positivas e fazê-los crescer em uma placa de 24 poços . Inocular a um frasco de 25 ml , 75 ml de balão e , finalmente, para um frasco de 125 ml . Depois de ter uma população de células estáveis, crescer em um biorreator de hibridoma para produção em massa.

8

refazer todo o protocolo começando com as células produtoras de IgG1 para obter uma linha de células produtoras de IgG2b . Depois de ter a linha celular IgG2b , repita todo o protocolo mais uma vez para obter a linha de célula produtora de IgG2a . Será que os testes ELISA com anticorpos anti- rato IgG2b ou IgG2a em vez de IgG1, dependendo de qual subclasse você está isolando .