Os protocolos para ELISA

Um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima ( ELISA ) é um teste imunológico sensível para detectar a presença de antigénios , em amostras biológicas . O ELISA utiliza anticorpos específicos ligados a uma enzima que é detectável através da utilização de absorção passiva de luz . Existem dois tipos comuns de ELISA : o ELISA direto e Sandwich ELISA . Princípios básicos de um ELISA

Um ELISA utiliza antigénios que são adsorvidos a poços de placas de microtítulo de plástico, que são então bloqueados através de um agente para cobrir toda a superfície aberta esquerda do poço . O testador adiciona um anticorpo primário de aderir especificamente para o antigénio e , em seguida, adiciona um anticorpo secundário , combinada com uma enzima que reage , de se ligar ao anticorpo primário . O aparelho de teste , em seguida adiciona um substrato que muda de cor para visualizar a concentração do antigénio . A cor dos aumentos de substrato juntamente com a concentração do antigénio .

Reagentes para ELISA

protocolos descritos em " Methods in Molecular Biology " requerem os seguintes reagentes para o quer tipo de ELISA : tampão bicarbonato de revestimento ; PBS contendo albumina de soro bovino e de Tween 20 ; tampão de fosfato ; tampão de citrato ; solução parar ; Solução de lavagem PBS e água oxigenada. Os protocolos de descrever adicionalmente composições e percentagens específicas para cada um dos reagentes .
Directa ELISA

Adicionar tampão de carbonato a cada poço de uma placa de microtitulação , seguido por antigénio diluído em um tampão de revestimento de bicarbonato . Incubar à temperatura ambiente durante duas horas ou durante a noite . Lava-se a placa e deixa-se secar à temperatura ambiente . Adicionar de rábano conjugada com peroxidase a cada poço , diluída para uma concentração adequada , e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante duas horas adicionais . Adicionar o tampão de bloqueio e lavar cada poço com uma solução de lavagem . Adicionar tampão citrato a cada poço e permitir o desenvolvimento da cor . Após 10 minutos , parar a reacção com tampão de paragem . Medir absorbância em espectrofotômetro .
Sandwich ELISA

Com base no trabalho de Munro e Lasley (1988), o sanduíche ELISA utiliza uma peroxidase ligante , anti-soro e comercial padrões de uma placa de microtitulação de 96 poços . Os poços da placa são revestidas com anti-soro diluído em tampão de revestimento de bicarbonato . Selar firmemente placas e incubar durante 12 horas a 4 graus Celsius . Dilui-se o conjugado de enzima em tampão fosfato . Remover o excesso de anticorpo com uma solução de lavagem e deixa-se secar à temperatura ambiente . Dispensar tampão fosfato a cada poço seguido de solução do conjugado , contendo padrões ou de amostras . Cobrir as placas durante duas horas. Lavar as placas e deixar secar à temperatura ambiente . Adicionar tampão de citrato de poços e deixar a cor se desenvolva . Aos 60 minutos, parar a reacção com a solução stop. Medir a absorvância com espectrofotômetro .