Técnicas de Du Pont Western Blot

blotting Du Pont ocidental é uma técnica destinada a dizer quanta proteína tem acumulado nas células selecionadas. Ele utiliza a electroforese em gel de proteínas desnaturadas pelo comprimento da cadeia polipeptídica . A técnica original foi desenvolvido no laboratório de George Stark na Universidade de Stanford, e foi dado o seu nome por W. Neal Burnette . No entanto , Western Blot não detectar com grande precisão quando uma proteína degrada rapidamente. Objectivo da Técnica

Independentemente de se a proteína em questão foi sintetizado in vivo ( natural ) ou in vitro ( em laboratório ) , técnicas de Du Pont de Western Blot é capaz de detectar uma proteína numa mistura de qualquer número de proteínas . Eles fornecem informações sobre o tamanho da proteína em questão . O método é , no entanto , dependentes da provisão de um anticorpo de alta qualidade dirigido contra a proteína desejada . Uma pequena porção da proteína deve ser capaz de ser produzido a partir de um fragmento de DNA clonado , e este anticorpo é usado para detectar a proteína de interesse .

Realização da Técnica

em primeiro lugar, as proteínas devem ser separadas por tamanho através da utilização da técnica de electroforese em gel . Em seguida , uma membrana de nitrocelulose deve ser colocado sobre o gel , e a electroforese devem ser empregues para dirigir as bandas de proteína na membrana de nitrocelulose . Depois disso, a membrana de nitrocelulose é incubada com um anticorpo primário , o qual adere à proteína , em seguida, com um anticorpo secundário . Este anticorpo secundário é utilizado como um conjugado de anticorpo – enzima , e destina-se a ficar com o anticorpo primário . As funções de enzima conjugada para ajudar a visualizar o que está ocorrendo .

Detecção radioativa

Na técnica de Du Pont Western Blot , a enzima clonada pode ser visto em ação utilizando o método de detecção radioactiva . Em primeiro lugar , a enzima clonada deve ser incubada com uma mistura de reacção que é específico para o enzima . Se o processo é realizado adequadamente , as bandas devem tornar-se evidentes no gel onde a proteína é em evidência . Um filme de raios – X pode ser colocado sobre o gel para detectar flash de luz que é emitida pela enzima .

Detecção Colorimétrico

Detecção Colorimétrico depende da incubação de Western Blot com um substrato concebido para reagir com a enzima repórter , ligado ao anticorpo secundário . Isto resulta na conversão do corante solúvel em uma forma insolúvel exibindo uma cor diferente que cora a membrana de nitrocelulose .

Detecção Fluorescente

No método de detecção fluorescente , um sonda marcada é excitado pela luz , e a emissão da excitação é subsequentemente detectada por um fotosensor equipado com filtros de emissão adequados . Isto captura uma imagem digital do Western Blot e permite ainda mais a análise de dados . Ele é considerado como sendo um dos métodos de detecção mais sensíveis Western Blot actualmente disponíveis .

Blotting Agente

Antes da adição do anticorpo primário , o gel deve ser de nitrocelulose incubado usando uma mancha . Albumina sérica bovina ( BSA) é frequentemente utilizado , mas , talvez surpreendentemente , Cravo Nonfat Dry Milk faz um dos melhores agentes de mata-borrão .