A remoção de etiqueta GST
Clonagem da proteína com a glutationa S – transferase ( GST ) do sistema de fusão de genes permite purificar facilmente a sua proteína usando uma cromatografia acoplado a glutationa . No entanto, para novas experiências , você pode querer remover a grande marca de GST de sua proteína. Isto pode ser conseguido com um tratamento com protease simples que cliva fora da ou N – C -terminal a partir do marcador GST da proteína . O procedimento pode ser diferente dependendo do sistema de fusão GST gene que você usou . Siga sempre as instruções fornecidas no manual do ICMS. Instruções
1
Dissolver 500 unidades de trombina em 500 microlitros de solução salina tampão fosfato frio. Agitar suavemente para fazer a protease dissolver . Isto faz com que uma solução de trombina de 1 U /microlitro . Se você estiver usando uma outra protease , siga as instruções especificadas no manual do seu GST
2
Mix 80 unidades – . 80 microlitros – de trombina em 920 microlitros de tampão PBS para cada mililitro de glutationa -Sepharose usado em seu coluna . Por exemplo , se você usou dois mililitros de glutationa sepharose para tornar a sua coluna, utilize 160 microlitros de trombina e 1840 microlitros de PBS. Se você estiver usando uma outra protease , siga as instruções especificadas no manual ao fazer sua mistura de protease.
3
Aplique a mistura de trombina na coluna de glutationa que você já aplicou o seu GST marcado proteína. A tag GST se liga ao glutationa, segurando sua proteína dentro da coluna . Você também pode remover a tag GST depois de ter sua proteína eluída da coluna através da mistura de sua proteína com a mistura thrmobin em um tubo.
4
Selar a coluna e incubar à temperatura ambiente por 2 a 16 horas . Algumas proteases podem ser incubadas em quatro graus Celsius . Seguir as instruções específicas no manual do ICMS.
5
Lavar a coluna com 3 volumes de tampão PBS coluna. Recolhe-se o fluxo de passagem em alguns tubos separados e analisá-las . O efluente contém a proteína , assim como trombina , enquanto que o marcador GST permanece ligado à coluna . Se você remover a tag GST em um tubo, sua proteína livre será misturado com a tag GST ea trombina.
