Microscopia de fluorescência Protocolos

A substância fluorescente ilumina quando excitados por luz de um comprimento de onda específico . A fluorescência ocorre naturalmente em algumas substâncias tais como a clorofila , mas a maior parte necessita de anexar as sondas fluorescentes chamados fluorocromos , ou ser tratada com um produto químico fluorescente . A fluorescência é usado para preparar certas estruturas biológicas para a detecção e análise por microscopia . Microscópio Fluorescente

O microscópio fluorescente opera por filtração através de apenas a luz com um comprimento de onda específico para a amostra fluorescente , geralmente a partir de um de mercúrio ou lâmpadas de xénon . A luz colide com a amostra , e os elétrons tornam-se animado e passar para um nível orbital superior. Como os elétrons retornam ao seu nível normal, a energia da luz é emitida . Isto é menos brilhante com um comprimento de onda maior do que a luz de excitação inicial , e torna-se visível através da utilização de um segundo filtro no microscópio que separa a luz emitida a partir da luz de excitação inicial.

Fixação

amostras são primeiro preparados antes de serem visualizadas em um microscópio fluorescente. No caso de células e tecidos , isto é feito por meio da fixação . A fixação permite a organização estrutural da amostra a ser mantido antes da coloração com uma sonda fluorescente . O uso de técnicas de fixação depende de factores tais como o tipo de sonda fluorescente utilizado , e o tamanho ou espessura da amostra . Existem várias técnicas de fixação , incluindo precipitações, criofixação e cross-linking

Fixação – . Cross- link

Cross- linking é uma técnica de fixação comum , onde um reagente que se liga a componentes intracelulares da amostra é adicionada . Aldeídos tais como o paraformaldeído e glutaraldeído são vulgarmente utilizados como reagentes de fixação , e que formam ligações covalentes com grupos de amina a partir da amostra , por meio da reacção ácido-base de Schiff . Os aldeídos são considerados um cancerígeno e deve ser tratado dentro de uma coifa. Os reagentes de reticulação são geralmente dissolvidos em um tampão adequado , tal como fosfato tamponado salino (PBS ) , que ajuda a manter a célula próxima do seu estado fisiológico normal , sem perturbar a sua estrutura celular . Tampões contendo aminas não são recomendadas porque eles ligam-se ao reagente de ligação cruzada .

Coloração

fluorocromos são geralmente concebidos em torno de compostos orgânicos aromáticos , que se ligam ao biológico amostra . Em amostras de células , fluorocromos também monitorar a viabilidade das células , incluindo a apoptose , a fluidez da membrana , endocitose , exocitose e atividade enzimática . Fluorocromos comuns usados ​​em microscopia fluorescente são rhodamine e manchas Hoechst . Rodamina é usado para identificar um conjunto de moléculas biológicas , incluindo ácidos nucleicos , proteínas , lípidos, hidratos de carbono , hormonas e toxinas . Rodamina tem uma alta fotoestabilidade , extinção , rendimento quântico fluorescente , e um baixo grau de formação de tripleto . Os dois tipos de manchas Hoechst , 33258 e 33342 , são usados ​​principalmente para rotular DNA. Eles podem ser utilizados para corar as células vivas e podem também visualizar mitocôndrias e núcleos . Manchas Hoechst interromper a replicação do DNA durante a divisão celular , como resultado da ligação de seu DNA e são , portanto, considerado cancerígeno e mutagênico.