Um tutorial para PCR Primer Projeto

O projeto da reação em cadeia da polimerase ( PCR) é uma habilidade que todos os cientistas biológicos devem dominar . PCR é um procedimento experimental amplamente utilizado para amplificar segmentos de genes e gerar milhares de cópias para posterior análise científica. Os iniciadores de PCR são fragmentos de ADN curtos , denominados oligonucleótidos , especificamente concebidos para reconhecer e hibridar com um segmento de DNA dentro de uma parte muito maior . Isto permite que outros ácidos nucleicos fornecidos na mistura de reacção de PCR, para se ligar ao iniciador , e a sequência de ADN alvo reconhecido para ficar amplificado . Instruções

um tutorial para PCR Projeto Primer

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Procure sempre primers existentes. Verifique revistas científicas e bases de dados primários , por exemplo, primerdb , para seqüências de primers que foram utilizados em outros experimentos e cientificamente demonstrado para trabalhar existente. Infelizmente, por causa desenho de primers e reações de PCR são processos difíceis, cientistas profissionais tendem a usar primers e parâmetros de reação que já foram publicados e validados experimentalmente .

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Encontre um software de design de primer. Um dos mais antigos e mais amplamente utilizado é Primer3 , que está disponível gratuitamente como uma ferramenta web . Outros incluem oligocalc , Oligo 7 , PrimerQuest ou OligoAnalyzer . De preferência , isso deve ter sido uma ferramenta recomendada a você por um cientista sênior atualmente usá-lo, porque todo o software de desenho de primers terá desafios técnicos e exigem solução de problemas, um biólogo molecular experiente . Envie seu sequência do gene alvo para o formato , por exemplo , FASTA ou texto, conforme especificado pelo software é usado.

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Selecione a seqüência dentro do seu gene alvo escolhido , conhecido como o ” modelo. ‘ Olhe para a seqüência de várias regiões escolhidas para a estrutura secundária ( regiões da sequência que dobrar e ligar) e evitá-los sempre que possível. Além disso, evite regiões com mais de quatro bases consecutivos idênticos , ou seja , se repete. Finalmente , certifique-se de que o GC atual, ou guanina – citosina, o conteúdo não exceda 60 por cento.

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Executar o software de design de primer. Especifique um comprimento cartilha de 18 a 24 nucleotídeos. Definir parâmetros , como temperatura de fusão a ser de 55 a 80 graus Celsius , o conteúdo GC de 40 a 60 por cento. Coloque um ” grampo GC ‘ na extremidade 3’ da sequência de primer , digitando manualmente em uma seqüência de ‘G’ ou nucleotídeos ‘C’ . Adicionar ou remover a ‘G’ ou bases ‘C’ até a temperatura de fusão é aceitável.

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Efetuar verificações finais. Estas verificações dependem do propósito original da PCR para que os primers estão sendo projetados . Você pode verificar a existência de auto- hibridação ou a formação de dímeros de iniciadores , estruturas sinuosas ou seqüência especificidade. Por exemplo, se a PCR é detectar mutações de uma única base , então você deve verificar se a sua cartilha reconhece apenas o modelo que está sendo ampliado.