Como projetar primers para a PCR RT

reversa reação em cadeia da polimerase com transcrição (RT PCR) faz cópias de DNA de modelos de RNA . Este é o oposto da ordem natural de copiar modelos de DNA para fazer transcrições de RNA . É usado para fazer uma cópia de ADN de sequências de RNA ” exão ” expressas – ” . Introns ” , sem os intervenientes não transcritas Fazendo iniciadores para RT PCR utiliza o facto de que são excluídos os intrões da sequência . Instruções

1

Use seqüências reais de DNA para comparação com o cDNA , que é mais facilmente conseguido através de um computador. Você precisa localizar as posições intron .

2

Projete seus iniciadores a partir do cDNA de sequências de exão que seriam localizados em cada lado de um intron em seu DNA. No modelo de cDNA , o primer seria uma sequência de exão contínua enquanto que no ADN do iniciador seria dividido por um intrão . Você pode confirmar a amplificação real da sequência de cDNA , mais tarde, como o primer não vai emparelhar com DNA contaminando porque o intron vai interromper o primer.

3

Siga parâmetros de projeto cartilha normais , além de colocação intron . Em outras palavras , você quer evitar uma seqüência que vai temperar a si mesmo ( loops de forma hairpin ) ou que irá ligar com a outra cartilha ( dímeros forma de primers ) .

4

iniciadores do projeto de modo que eles são 18-30 nucleótidos de comprimento , com uma temperatura de fusão entre 45-65 graus Celsius . Evite longas repetições de bases e escolher uma sequência com um conteúdo GC de 40-60 por cento . Verifique se o seu ‘ (três prime) final 3 não é muito pesado em Gs e Cs para evitar que vários sites priming .