O que ocorre em primeiro lugar na produção de um plasmídeo recombinante

Virtualmente todo o DNA é composta de quatro bases : adenina ( A) , citosina ( C ) , guanina ( G) e timina ( T ) . Este notável coerência entre espécies permite que genes de um organismo para ser recortado e colado no genoma de outro organismo. Por exemplo , genes de proteínas de medusas fluorescentes foram introduzidos em bactérias , o que produz a proteína . Os plasmídeos contendo o DNA de outras espécies são chamados plasmídeos recombinantes . Gene de selecção

O primeiro passo na produção de um plasmídeo recombinante é o de identificar quais o gene ou genes para introduzir num plasmídeo preexistente . Para além do gene ( s ) de interesse , um gene indicador é escolhido para diferenciar as células recombinantes a partir de células não recombinantes em passos posteriores do processo . O gene indicador mais comum é um gene de resistência a antibiótico não nativas das espécies hospedeiras de modo que apenas as células recombinantes terão o gene de resistência a antibióticos conferida pelo plasmídeo .

Seleção site

As enzimas de restrição cortar DNA apenas em sequências específicas . Alguns produzem os chamados extremidades ” pegajosos ” , em que um fio é de alguns pares de bases mais longa do que a outra , enquanto que outros produzem extremidades lisas , nas quais ambas as cadeias são cortadas no mesmo local . Mapas de restrição , mostrando todos os locais de corte de enzimas de restrição conhecidos estão disponíveis para muitos plasmídeos. Utilizando estes mapas , os cientistas escolher os locais de restrição compatíveis no plasmídeo e em ambos os lados dos genes de interesse , a fim de cortar os genes para fora do seu DNA nativo e fazer aberturas para elas no plasmídeo .

enzima de Restrição a digestão

digestão com enzimas de restrição é o processo de incubação o ADN para ser cortado com as enzimas de restrição apropriadas . Porque o ADN desejado é agora misturado com fragmentos de outros ADN , cientistas usar electroforese em gel para separar os fragmentos por tamanho e isolar o DNA pretendido . Isto é seguido por ligação , em que as extremidades dos genes seleccionados são unidos com as extremidades do plasmídeo . O plasmídeo recombinante contém agora os genes de interesse e o gene de resistência a antibiótico .

Amplificação

amplificação é a cópia de massa de material genético . No caso de um plasmídeo recombinante , o plasmídeo é introduzido nas células bacterianas . Nem todas as células vão ter êxito em um plasmídeo de modo que as células são cultivadas em meio contendo um antibiótico que é letal para as bactérias não recombinantes . Porque as células recombinantes têm o gene de resistência a antibióticos conferida pelo plasmídeo , só irão sobreviver e multiplicar-se. As células são então lisadas , ou quebrado , e o ADN é extraído e purificado .