Como utilizar uma coluna de fase reversa para a Primeira Vez

cromatografia de fase reversa , ou RPC , é usado para purificar proteínas e outras moléculas que formam interacções hidrofóbicas com a matriz da coluna , também chamada fase sólida . A coluna é lavada e equilibrada com um solvente aquoso que facilita a ligação da sua molécula hidrófoba amostra com a matriz da coluna hidrófoba . A molécula da amostra pode ser eluida da coluna por forma a aumentar a hidrofobicidade do solvente aquoso , adicionando gradualmente solvente orgânico no solvente aquoso . Para purificar com sucesso a sua proteína , é essencial que você se equilibrar , lavar e eluir a coluna corretamente. Instruções

1

Prepare a sua coluna de fase reversa por equilibrando -a com 10 volumes de solução de lavagem da coluna. Este é normalmente conhecido como tampão ou solvente A. Tampão A é um solvente à base de água com 0,1 por cento de ácido . O mesmo tampão A é utilizado , em conjunto com o tampão B orgânico , para eluir a sua amostra . O ácido fórmico , ácido trifluoroacético ou ácido acético são comumente usados ​​para fazer tampão A. Faça solução de 0,1 por cento , adicionando um mililitro de ácido em 1 litro de água .

2

Aplique sua primeira amostra na coluna . Prepare a sua amostra , diluindo -o em tampão A.

3

Lavar a coluna com 5 volumes de tampão de 100 por cento A. coluna Isso ajuda a lavar todas as moléculas extras em sua amostra que não se ligam para a coluna , deixando apenas sua molécula amostra ligam-se para trás.

4

Eluir sua amostra , aumentando gradualmente a hidrofobicidade da solução de eluição. Isto é conseguido através da mistura gradual de tampão A e tampão B, em conjunto . Comece com tampão de 99 por cento e um tampão de 1 por cento B e, gradualmente, aumentar a quantidade de tampão B e diminuir a quantidade de tampão A. No final do gradiente , a solução de eluição é tampão de 0 por cento e 100 por cento de uma tampão B.

5

Colete todo o solvente que sai da coluna depois de iniciar a eluição. Isso geralmente é feito coletando algumas frações mililitro em pequenos tubos. Isso garante que você não vai perder o seu exemplo , se você não sabe em que momento concentração do tampão ponto B elui a partir da matriz da coluna. A maioria das máquinas de cromatografia são equipados com um espectrómetro que analisa cada fracção de proteína . Descartar todas as fracções que não contêm proteína e salvar apenas as frações que são positivos para a proteína.

6

Lave sua coluna com 10 volumes de tampão de 100 por cento A depois de ter executado todo o gradiente de eluição . Depois disso, sua coluna está pronto para a segunda amostra ou ser regenerado e preparado para o armazenamento.