Métodos de isolamento de proteínas

Proteínas são isolados a partir de células ou tecidos pulverizados. Uma vez que a célula for arrombado , ao seu conteúdo ou lisado é recolhido para purificação adicional com base nas propriedades da proteína , tal como o seu tamanho, carga e de ligação por afinidade específica . Apesar de existirem muitos protocolos técnicos , existem alguns métodos utilizados rotineiramente .

proteínas são rotineiramente e facilmente isolado utilizando técnicas bem estabelecidas em diferentes contextos biológicos e farmacêuticos .

diálise

Este método envolve a filtração de uma solução de proteína de lisado ou diluído por meio de um semi -permeable membrana , de modo que as proteínas maiores do que o diâmetro dos poros pontuando a superfície da membrana e retidos apenas os mais pequenos são extrudidos . A diálise pode também ser utilizada para concentrar a solução de proteína; no entanto, porque este método não pode diferenciar eficientemente proteínas , muitas vezes é seguido por outras técnicas mais específicas. Os sistemas automatizados já existem que podem realizar diálise , e vários kits comerciais também fornecem os reagentes necessários ( soluções ) .

Precipitação e solubilização

As proteínas não fazer dissolver ( ou ” solubilizar ” ) bem em soluções de concentrações elevadas de sal . Esta propriedade de solubilidade será diferente entre as proteínas e é uma boa maneira de distinguir entre aqueles intimamente relacionadas . A partir de uma solução de várias proteínas , aumentando a quantidade de sais como sulfato de amónio pode ser utilizado para fraccionar e precipitar as proteínas maiores primeiro ( com menores níveis de sulfato de amónio ) , e , por conseguinte, também a concentrar-se amostras muito diluídas . Este é o método mais utilizado devido à sua simplicidade .

Cromatografia

Este inclui gel – filtração, de troca iônica , afinidade e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC ) . Em todos os casos , o lisado é deixada fluir através de uma coluna que continha esferas porosas de características diferentes , mas específicas . Cromatografia de filtração em gel para separar pequenas proteínas de maiores, utiliza contas feitas a partir de materiais tais como dextrano , poliacrilamida ou agarose . Cromatografia de troca iônica separa proteínas de carga usando pérolas líquidas que têm grupos carboxilato sobre eles. As proteínas que aderem às esferas são mantidas , enquanto que aquelas que se ligam fracamente ou não em todos fluir direto e são recolhidas na outra extremidade da coluna. Também é possível recuperar a proteína , que foi ligado . Esta abordagem é utilizada em cromatografia de afinidade , que explora a afinidade de uma proteína para ligantes químicos específicos . A proteína ligada é lavada a partir da coluna , inundando as esferas com uma solução para diminuir a ligação . HPLC é uma resolução maior , mais rápido e versão muito melhorada de cromatografia.

Ultra- centrifugação

Soluções de proteínas de diferentes massas ou densidades podem ser separadas com base na tempo que leva a afundar ou sedimentar para o fundo de um tubo durante a centrifugação . Partículas mais pesadas e /ou densas vai agregar primeiro , enquanto os mais leves ou menos densas permanecerá dissolvido. Separação de proteínas é realizada numa solução contendo camadas de um aumento ou diminuição da concentração do material , tal como a sacarose ou alguns outros meios, tais como Percoll . Ultracentrifugação neste ” gradiente de concentração ” permite a separação de proteínas grandes de menores. Tanto o pellet e sobrenadante (contendo as proteínas menores ) podem ser recolhidos para posterior purificação ou análise.

Conclusão

Os bons métodos de isolamento trará grandes quantidades e alta purificação proteínas , e em cada caso , as exigências experimentais posteriores devem ser levados em consideração quando da escolha do método mais adequado para usar. Bons recursos para mais detalhes e protocolos precisos são Clive Dennison de ” Um guia para o isolamento das proteínas ‘ ( Kluwer , 2003) e Hafiz Ahmed de ‘ Princípios e reações de extração de proteínas , purificação e caracterização ( CRC Press, 2005 ) . No entanto a maioria dos protocolos e laboratórios Uso Profissional desenvolvido comercialmente kits que consistem em etapas técnicas simples e eficientes , mas mais importante , de alta pureza , para o isolamento de várias classes de proteínas.