Como projetar um Sequencing Primer

Os melhores primers de sequenciamento são sequências únicas que recozimento apenas para o trecho pretendido de DNA modelo com precisão a temperatura de gama média . Eles não formam lacetes em grampo — isto é, dobra para trás e que se emparelham — nem se fundir com o outro iniciador ( forma dímeros de iniciadores ) . Instruções

1

Projete o primer com base em um comprimento de seqüência de pelo menos cinqüenta nucleotídeos de distância das extremidades do DNA template que você deseja estender. Você quer uma boa sobreposição .

2

Escolha uma seqüência que não tem longos trechos de qualquer uma das bases , especialmente longos trechos de Gs ou Cs.

3

Escolha um comprimento entre 18 a 30 nucleótidos de comprimento com pelo menos 40 a 60 por cento de conteúdo de GC . Isto lhe dará um ponto de fusão ideal ( Tm) faixa de entre 45 a 65 graus Celsius.

4

Confira a sequência contra seqüências no GenBank para ter certeza de que você não escolheu um sítio ativo , tais como um domínio comum que primo não especificamente a múltiplos genes.

5

Certifique-se que 3 ‘ (três prime) final do seu cartilha não é tão pesado em Gs e Cs que se liga a vários sites

6

. Escrever ambos os primers na 5 ‘para 3’ (cinco privilegiada para três prime) direção ao fazer o pedido . Isso vai exigir que você escreva o complemento reverso do seu primer reverso .