Como usar o DNA recombinante para a modificação genética
DNA recombinante ( rDNA ) refere-se a mistura de uma ou mais diferentes cadeias de DNA para produzir um um novo e inteiramente sintético. Uma vez que o ADN recombinante tenha sido inserido numa célula , a engenharia de proteínas é então expressa pela célula modificada . O processo de modificação genética usando ADNr é conhecida simplesmente como gene ou recombinação ( ou de recombinação ) a clonagem . Este artigo é uma breve visão geral das etapas envolvidas na técnica científica sofisticada de modificação genética , utilizando a reação em cadeia da polimerase para construir rDNA.Things Você vai precisar de
reagentes de amplificação de reação em cadeia da polimerase ( buffers , enzimas , DNA molde, primers ) e termocicladores
pipetas
tubos PCR ou placas
Nucleicos mancha ácido (por exemplo , brometo de etídio , GelStar )
Gel equipamento de eletroforese ( agarose , tanques, executando buffers ) e mesa de luz UV
DNA reagentes de ligação (por exemplo , T4 DNA ligase e reação buffers , bloco de calor )
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Amplify e purificar o trecho de DNA de interesse: Use um protocolo de amplificação que tem já foram avaliados e otimizados para os reagentes de PCR disponíveis e específicos para o laboratório. Preparar os reagentes de PCR , tais como iniciadores e se fosforilar estes se ligadura de extremidades cegas é o método de clonagem de escolha . Para a PCR , geralmente de 20 a 25 ciclos de amplificação com a hibridação de um minuto a 50 graus Celsius são suficientes para produzir produtos completos . Tirar 5 a 10 microlitros do produto de PCR e rodá-lo para fora em um gel de agarose para visualizar e confirmar o tamanho do ADN . Recuperar e purificar os produtos de PCR por meio das técnicas básicas de extração fenol-clorofórmio e precipitação com etanol
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enzimaticamente digerir e repurify os fragmentos de DNA .: O usuário já deve saber o que de restrição da enzima locais estão presentes na DNA amplificado antes de iniciar qualquer trabalho, e esses sites serão usados na criação de uma digestão para ‘ introduzir ‘ os locais nu para os fragmentos . Usar aproximadamente metade do volume total amplificada por esta e após a digestão , os fragmentos repurify por gel e extracção com fenol – clorofórmio ou outros métodos
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ligação de ADN e de transfecção celular : . Realizar uma ADN experiência de ligação para colocar o fragmento restringido dentro de um vector que pode ser transfectado para uma célula bacteriana . As células vão transcrever o novo gene recombinante e produzir grandes quantidades do mesmo. Crescer estas bactérias e realizar subclonando experimentos para permitir a seleção de potenciais transformantes
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Analise os subclones para confirmar o gene modificado .: Depois de mini , vetores Midi , ou maxiprepping o plasmídeo ( expressão ), repita o processo de digestão de enzimas de restrição e visualização em gel, e sequenciar o fragmento amplificado para verificar se há mutações estão presentes.
